基于Base editing技术的iStop基因敲除

传统方法构建基因敲除模型小鼠是在小鼠胚胎干细胞中通过同源重组的方法敲除掉一个外显子,该方法效率低,实验周期长,且干细胞打靶需要通过囊胚注射,获得的F0代小鼠是嵌合体...

  传统方法构建基因敲除模型小鼠是在小鼠胚胎干细胞中通过同源重组的方法敲除掉一个外显子,该方法效率低,实验周期长,且干细胞打靶需要通过囊胚注射,获得的F0代小鼠是嵌合体,需要嵌合到生殖嵴才能繁育出F1代的基因敲除小鼠。利用CRISPR/Cas9技术在小鼠受精卵阶段注射可以实现一步法获得基因敲除小鼠,但是该技术是基于非同源重组的方式通过移码突变造成基因敲除,只能保证三分之二的概率造成移码突变,因此F0代小鼠仍旧是部分细胞敲除的嵌合体小鼠,需要繁育到F1代才能进行实验。

  2016年发表于Nature的Base editing技术,能够在不造成DNA双链断裂的情况下,通过单碱基编辑实现C突变成T,形成提前的终止密码子,造成基因的功能性敲除。利用该技术能够获得F0代大多数是完全基因敲除的小鼠,可以进行功能学分析,交配到F1代再进一步确认表型,适用于需要快速获得基因敲除的模型小鼠,或者大规模在体筛选。该技术还可以实现在F0即可获得多基因同时敲除的小鼠,适用于多功能协同作用的研究项目。
 

  技术优势

  无需造成DNA双链断裂,极大的减少Off-target;

  高效形成提前的终止密码子,可在F0代实现功能性的基因敲除;

  可在短时间内获得大量的功能性敲除小鼠;

  可同时敲除多达三个基因。

  适用范围

  适用于绝大部分需要基因敲除的研究;

  适用于需要快速获得可用于表型分析的基因敲除小鼠;

  适用于需要在小鼠中进行多个基因筛选的研究;

  适用于需要多基因同时敲除的模型小鼠。

  实验流程